Wirusy są bezwzględnymi pasożytami wewnątrzkomórkowymi. Mogą przetrwać poza komórką, ale nie są w stanie rozmnażać się bez wykorzystania metabolizmu oraz kwasów nukleinowych komórki. Pojedyncza cząstka wirusa – winion – zbudowana jest z pojedynczej lub podwójnej nici kwasu nukleinowego (RNA albo DNA) oraz otaczającego ją białkowego kapsydu. Niektóre wirusy posiadają jeszcze dodatkową otoczkę. Na świecie jest ponad 200 chorób wirusowych występujących u zwierząt. = Tekst pochodzi ze stron PCI papugi.dt.pl i nie powinien znajdować się nigdzie indziej

Diagnostyka wirusologiczna opiera się na dwóch możliwościach: wykrycia wirusa (bezpośrednia obserwacja wirusa, wykrycie antygenów) albo oceny dopowiedzi immunologicznej organizmu (wykrycie przeciwciał). Wykrycie wirusa jest możliwe poprzez jego namnożenie, izolację i bezpośrednią obserwację oraz poprzez wykrycie antygenów lub kwasu nukleinowego wirusa. Ocena odpowiedzi immunologicznej organizmu jest możliwa poprzez wykrycie w organizmie swoistych przeciwciał. Trzeba pamiętać, że wykrycie przeciwciał nie jest jednoznaczne z określeniem czynnika etiologicznego choroby. Przeciwciała oznaczają bowiem często tylko zetknięcie się organizmu (kiedyś w przeszłości) z danym patogenem, mogą też być odpowiedzią poszczepienną. Dlatego aby tego typu badanie powiedziało coś więcej, wykonuje się je co najmniej dwa razy. Pierwsze w początkowym, ostrym stadium choroby, a drugie w późniejszym (po około 7-10 dniach).

Wybór konkretnej metody diagnostycznej zależy od podejrzeń co do gatunku wirusa, a to na ogół wynika z obrazu klinicznego choroby. Często też podyktowany jest możliwościami laboratorium, z którym lekarz współpracuje, a czasem także ceną badania. Badania wirusologiczne należą bowiem do droższych badań laboratoryjnych. Niezależnie od wybranej metody, aby wyniki były miarodajne, trzeba przestrzegać kilku zasad. Przede wszystkim materiał diagnostyczny musi być prawidłowo dobrany, następnie musi być prawidłowo pobrany, przechowywany i transportowany. Konieczne jest też prawidłowe opracowywanie materiału w laboratorium.

Metody badań

Na początku badań wirusologicznych stosowano zakażanie zwierząt laboratoryjnych, potem zaczęto hodować wirusy na hodowlach komórkowych. Później opracowano metody serologiczne. Dzisiaj stosuje się najnowocześniejsze metody biologii molekularnej polegające na izolacji kwasu nukleinowego wirusów.

Dodatni wynik badań wirusologicznych pozwala na potwierdzenie wcześniejszego rozpoznania na podstawie objawów klinicznych. Trzeba jednak pamiętać, że czasem wirus, który jest obecny w organizmie nie jest czynnikiem etiologicznym choroby. Wynik ujemny nie pozwala na wykluczenie choroby ponieważ może on być następstwem pobrania materiału w nieodpowiednim czasie lub z nieodpowiedniego miejsca, błędów przy pobraniu, przechowywaniu i transporcie itp. = Tekst pochodzi ze stron PCI papugi.dt.pl i nie powinien znajdować się nigdzie indziej

Metody mikroskopowe

W mikroskopie świetlnym można obserwować zmiany degeneracyjne, tzw. efekt cytopatyczny. W ten sposób można wstępnie rozpoznać typ wirusa. Niektóre wirusy powodują powstawanie charakterystycznych wtrętów, inne jednak nie powodują żadnych widocznych zmian cytopatologicznych. Dokładniej można uwidocznić zmiany stosując barwienie hematoksyliną i eozyną. Efekt cytopatyczny spowodowany replikacją wirusa następuje na ogół pomiędzy 3. a 10. dniem po zakażeniu komórek. Wystąpienie efektu cytopatycznego już w 1 lub 2 dniu inkubacji świadczy na ogół o zanieczyszczeniu materiału innymi czynnikami toksycznymi.

W przypadku kiedy wirus nie powoduje efektu cytopatycznego można próbować stwierdzić obecność wirusa na podstawie interferencji wirusowej. Polega to na tym, że po pewnym czasie inkubacji dodajemy do próbki znanego wirusa, który powoduje zmiany degeneracyjne komórki. Jeśli po kolejnym okresie inkubacji zmiany takie nie zajdą, to można przypuszczać, że „pierwszy” wirus nie dopuścił do zakażenia komórek wprowadzonym „drugim” wirusem. Można też wykorzystać zjawisko hemaglutynacji.

W mikroskopie elektronowym można bezpośrednio obserwować wirusy. Nie jest to jednak metoda powszechnie wykorzystywana ze względu na to, że mikroskopy elektronowe nie są standardowym wyposażeniem laboratoriów, są drogie i sama diagnostyka za ich pomocą jest kosztowna. Poza tym bezpośrednia obserwacja wirusa pozwala w większości przypadków jedynie na różnicowanie wirusów na poziomie rodzin, a nie niżej.

Preparaty do obserwacji w mikroskopach elektronowych to np. bardzo cieniutkie skrawki badanego materiału zatopione w żywicy epoksydowej i barwione negatywowo kwasem fosforowolframowym.

W niektórych przypadkach w mikroskopie elektronowym można obserwować kompleksy antygen-przeciwciało (mikroskopia immuno­elektornowa).

Metody immunofluorescencyjne

W szybkiej diagnostyce wirusologicznej bardzo pomocne są metody mikroskopii immunofluorescencyjnej (metody IF). Metody te są szeroko stosowane w badaniu nie tylko materiału pochodzącego z hodowli, ale przede wszystkim materiału pobranego bezpośrednio do chorego zwierzęcia. Metody te służą do identyfikacji przeciwciał należących do określonej klasy immunoglobulin i o określonej aktywności przeciwwirusowej (np. IgM, IgG). Metody te mogą być bezpośrednie i pośrednie. W metodzie bezpośredniej wykorzystuje się znakowaną odpornościową surowicę dla danego wirusa, a w pośredniej znakowaną surowicę antyglobulinową i odpowiednią swoistą surowicę odpornościową dla danego typu wirusa. Dzięki temu można wykazać obecność antygenów wirusowych. Poza testem właściwym wykonuje się też testy kontrolne, np. z surowicą ujemna, wzorcowo dodatnią, słabo dodatnią, a także kontrolę antygenów, jałowości i stężenia odczynników. Zaletą tych metod, poza szybkością, jest też fakt, że preparaty do badań immunofluorescencyjnych można przesyłać do pracowni wirusologicznych w postaci utrwalonych rozmazów na szkiełku. Wadą są stosunkowo wysokie koszty. Metoda ta jednak jest nadal powszechnie stosowana zwłaszcza w tych przypadkach, w których nie można zastosować metod immunoenzymatycznych.

Metody radioimmunologiczne

Metody te umożliwiają wykrywanie antygenów i przeciwciał. Opierają się na konkurencyjności znakowanego i nie znakowanego antygenu. Rozdzielenie kompleksów pozwala na odczyt diagnostyczny. Do celów praktycznej diagnostyki opracowano wiele metod, najpowszechniejsze są oparte na stałych podłożach (solid chase RIA). Komercyjne zestawy diagnostyczne pozwalają na wykrywanie wielu wirusów (antygenów) lub przeciwciał.

Metody radioimmunologiczne są bardzo czułe i swoiste, dają także odtwarzalne wyniki. Ich stosowanie jest jednak ograniczone ze względu na konieczność posiadania sprzętu pozwalającego na odczytanie próbek radioaktywnych oraz ze względu na kwestie ochrony środowiska.

Metody immunoenzymatyczne

Metody te mają bardzo podobne założenia jak opisane wyżej metody IF i RIA. Technika polega na tym, że na unieruchomionym, związanym z podłożem antygenie lub przeciwciele, które są znakowane enzymem (stad nazwa) wiąże się odpowiednik zawarty w badanej surowicy (odpowiednio przeciwciało lub antygen). Powstaje kompleks antygen-przeciwciało. Kompleks ten ujawniany jest poprzez zmianę koloru detektora. W metodach immunofluorescencyjnych było to świecenie fluorescencyjne, a w metodach radioimmunologicznych – promieniowanie radioaktywne.

Podstawową metodą immunoenzymatyczną jest ELISA (różne odmiany). Metoda ta jest aktualnie bardzo szeroko stosowana ze względu na niskie koszty i krótki czas oczekiwania na wyniki. Jest też bardzo prosta, a jej wykonanie wymaga jedynie staranności. Nie wymaga ona specjalistycznego sprzętu (odczyty można wykonywać wizualnie oraz z użyciem kolorymetru lub spektrofotometru), nie stwarza też zagrożenia dla środowiska. Teoretycznie można tą metodą wykrywać wszystkie wirusy, praktycznie diagnostyka laboratoryjna ograniczona jest dostępnością komercyjnych testów.

Rozwój komercyjnej diagnostyki wirusowej weterynaryjnej jest oczywiście znacznie wolniejszy niż w przypadku medycyny ludzkiej. Wiąże się to z dwoma zasadniczymi sprawami, po pierwsze jest to kwestia kosztów wyprodukowania takich testów, a po drugie w przypadku zwierząt konieczne jest opracowywanie testów dla różnych gatunków. Jednak wiele światowych firm produkuje gotowe zestawy służące do diagnostyki najważniejszych zakażeń wirusowych.

Trzy opisane wyżej metody są nazywane metodami szybkiego wykrywania wirusów.

Metoda neutralizacji

Metodą tą wykrywa się przeciwciała znoszące zakaźność wirusów; uzyskuje się istotne informacje odnośnie stanu odporności organizmu, a wykrywa zarówno przeciwciała jak i antygeny. W zależności do wirusa odczyn neutralizacji wykonuje się w hodowlach komórkowych, na zarodkach kurzych albo na zwierzętach doświadczalnych. Odczyn polega na zobojętnianiu zakaźności wirusa przez przeciwciała oraz na wykryciu pozostałości wirusa niezobojętnionego. Test ten wykazuje dużą czułość i swoistość.

Odczyn wiązania dopełniacza

Dzisiaj metoda ta jest stosowana coraz rzadziej, głównie ze względu na szerokie stosowanie metod immunoenzymatycznych. OWD pozwala na oznaczenie przyrostu miana przeciwciał.

Obie powyżej opisane metody są czasem wykorzystywane jako metody odniesienia, zwłaszcza dla metod diagnostyki molekularnej.

Metody hemaglutynacji, zahamowania hemaglutynacji, hemadsorpcji, immunohemadherencji

Metody te bazują na zdolności wielu wirusów do aglutynowania (zlepiania) oraz adsorbowania krwinek czerwonych; wykorzystują one zarówno zjawisko zlepiania krwinek jak i hamowania tego procesu, służą więc do identyfikacji zarówno wirusów (antygenów) jak i przeciwciał. Metody te są nadal wykorzystywane, choć są wypierane przez szybkie metody takie jak ELISA, IF czy RIA.

Metoda immunoadherencji jest w pewnym sensie połączeniem metod hemaglutynacji i OWD. Jej zastosowanie w diagnostyce wirusologicznej jest sporadyczne.

Metoda immunodyfuzji

Test przeprowadzany jest na półpłynnym żelu agarowym (inaczej metoda ta jest nazywana odczynem precypitacji w żelu agarowym - AGID). Antygeny i przeciwciała wędrują naprzeciw siebie i w miejscu zetknięcia powstaje linia precypitacji. Natężenie linii jest wykładnikiem stężenia reagujących składników, a liczebność linii precypita­cji jest wyrazem ich zróżnicowania. Metoda ta stosowana jest do diagnozowania rozpuszczalnych antygenów wirusowych.

Metody biologii molekularnej (genetyczne)

Ostatni okres przyniósł wielki rozwój biologii molekularnej. Umożliwiło to rozwój taksonomii wirusów, a także znalazło odzwierciedlenie w możliwościach diagnostycznych. Produkcja komercyjnych zestawów diagnostycznych spowodowała, że testy te stały się powszechne. Badania wirusologiczne oparte na biologii molekularnej idą w dwóch kierunkach. Jeden oparty jest na charakterystyce genomu wirusa, drugi na charakterystyce struktur białkowych.

Najpowszechniej stosowane są metody hybrydyzacji DNA oraz amplifikacji kwasów nukleinowych metodami PCR (różne odmiany).

Metoda polimerazowej reakcji łańcuchowej (PCR) polega na zwielokrotnianiu (amplifikacji) znajdującego się w próbce specyficznego fragmentu kwasu nukleinowego (DNA albo RNA) do takiej ilości żeby było możliwe wykrycie i sekwencjonowanie, co z kolei pozwala na dalszą identyfikację. = Tekst pochodzi ze stron PCI papugi.dt.pl i nie powinien znajdować się nigdzie indziej

Pozytywny wynik wskazuje na to, że w próbce znajdował się kwas nukleinowy danego wirusa. Wynik negatywny wskazuje, że w próbce nie było kwasu nukleinowego albo był w za małej ilości. Nie jest więc jednoznacznym wyznacznikiem braku danego wirusa w organizmie. Możliwe są też fałszywie ujemne wyniki wynikające z niewłaściwego pobrania i przechowywania materiału. Przede wszystkim jest to wielokrotne zamrażanie i rozmrażanie preparatu albo w przypadku krwi dodatek heparyny; krwi nie powinno się też zamrażać. Przy pobieraniu materiału przeznaczonego do badań genetycznych bardzo ważne jest też przestrzeganie odpowiedniego pobrania próbki i nie zanieczyszczenia jej. Metody te bowiem są bardzo wrażliwe i każdo zanieczyszczenie może spowodować problemy z przeprowadzeniem testu, a nawet całkowicie go uniemożliwić. Dlatego do pobrania tego typu materiału powinno się używać tylko jałowego sprzętu.

Podsumowanie

Badania wirusologiczne powinny być stałym elementem postępowania klinicznego. Aby takie badanie miało jednak wartość diagnostyczną konieczne jest nie tylko zachowanie pewnych wspomnianych wcześniej zasad postępowania z materiałem, ale także znajomość samych wirusów oraz ich roli w występujących zakażeniach.

W większości ostrych wirusowych zakażeń pierwszy okres charakteryzuje się zarówno wiremią, jak i sekrecją wirusów. W związku z tym izolacja wirusów w tym okresie ma największe szanse powodzenia. Badania serologiczne (odpowiedź humoralna) dają możliwości ustalenia znamiennego przyrostu przeciwciał w czasie, ustalenia ich aktywności w określonej klasie immunoglobulin, a także relacji stężeń przeciwciał w surowicy i czasem w płynie mózgowo-rdzeniowym. Badanie wykonane po ustąpieniu wiremii i wydzielania wirusów pozwala przede wszystkim potwierdzić przebyte zakażenie, ale nie daje odpowiedzi na pytanie kiedy to zakażenie miało miejsce. Dlatego najważniejsze jest przeprowadzenie badań w możliwie najwcześniejszym stadium choroby. Jest to istotne także z innego powodu. Wiele chorób wirusowych jest wikłanych przez późniejsze nadkażenia bakteryjne lub grzybicze co powoduje zanieczyszczenie pobieranego materiału i może prowadzić do fałszywych wyników.

Trzeba też pamiętać, ze kluczową rolę w badaniach wirusologicznych ma dobór miejsca, z którego pobrana zostanie próbka. Nawet najdoskonalsza metoda diagnostyczna niczego nie wykaże jeśli próbka zostanie pobrana z miejsca gdzie nie ma wirusa. = Tekst pochodzi ze stron PCI papugi.dt.pl i nie powinien znajdować się nigdzie indziej

Bibliografia: M. Kańtoch: „Wirusologia lekarska”, Wydawnictwo Lekarskie PZWL 1998; Z. Krzemiński: „Zarys wirusologii lekarskiej”, Łódź 1997; „Przewodnik po badaniach” IDEXX Vet-Med-Lab; E. Samorek – Salamonowicz: „Diagnostyka wirusologiczna chorób drobiu” [w:] M. Mazurkiewicz (red.): „Choroby drobiu”, Wrocław 2005. S. N. Sharma, S. C. Adlakha: „Textbook of Veterinary Virology”, New Dehli 2009.

Powyższy tekst to obszerne fragmenty mojej pracy z przedmiotu "Diagnostyka chorób zwierząt" w szkole weterynaryjnej.