Ze względu na powszechne stosowanie chemioterapeutyków (leki antybakteryjne) powstaje coraz więcej szczepów bakterii, które są oporne na wiele leków. Stwarza to coraz większe problemy w skutecznym leczeniu zakażeń bakteryjnych.

W badaniach laboratoryjnych można, różnymi metodami, identyfikować bakterie pochodzące z wydalin, wydzielin czy wymazów od zwierząt. Sama identyfikacja gatunku, a nawet szczepu bakterii, nie daje jednak jeszcze odpowiedzi na pytanie jaki lek najlepiej podać. Dopiero badanie bakteriologiczne z antybiogramem pozwala na skuteczne leczenie.

Antybiogram to wzór podatności danego szczepu na róże chemioterapeutyki (czasem zamiennie używa się nazw antybiotyk i chemioterapeutyk). Mówi on nam na jaki lek konkretne powodujące chorobę w tym konkretnym przypadku, są wrażliwe (tzn. jakie leki są w stanie je zabić), a na jakie są oporne. Więcej o samych antybiotykach: artykuł.

Metoda dyfuzyjno krążkowa

Jest to najpowszechniejszą formą testu, wykonywana jest ręcznie. Można ją wykonać w każdym laboratorium, nie wymaga specjalistycznego sprzętu i odczynników.

Na odpowiednie podłoże stałe (agarowe Mueller–Hinton czyste lub z dodatkami) posiewa się czystą hodowle patogenu w taki sposób aby cała powierzchnia była pokryta wzrostem bakteryjnym, tzw. murawką. Następnie na powierzchni płytki umieszcza się małe krążki bibuły nasączone różnymi antybiotykami. Podczas inkubacji antybiotyk dyfunduje z krążka do podłoża i wokół krążka powstaje strefa zahamowanego wzrostu. Ocenie podlega wielkość (średnica) strefy zahamowania wzrostu. Cała procedura musi być zestandaryzowana (rodzaj podłoża, gęstość inokulum itd.).

Jedną z powszechniej stosowanych metod jest dysk Kirby-Bauer.

Test dyfuzji krążkowej nie nadaje się do bakterii o wolnym wzroście, takim jak np. prątki gruźlicy.

odczyt

• Oporność – brak strefy zahamowania, bakterie rosną przy krążku.
• Oporność pośrednia – wąska strefa braku wzrostu wokół krążka.
• Wrażliwość – szeroka strefa wokół krążka wolna od wzrostu. Inaktywacja enzymatyczna – wąska strefa braku wzrostu wokół krążka, od oporności pośredniej różni się ostro zarysowanym brzegiem strefy. W przypadku gdy bakteria wytwarza enzymy inaktywujące antybiotyk (np. szczepy Staphylococcus, które kodują indukowaną beta-laktamazę). Bakterie w pobliżu krążka nie zdążą wytworzyć odpowiedniej ilości enzymu zanim zostaną zabite. Bakterie w dalszej odległości od krążka wytworzą wystarczająco dużo enzymu żeby przeżyć.
• Działanie selektywne – w przypadku dwóch szczepów o różnej wrażliwości na dany antybiotyk; w pobliżu krążka działanie antybiotyku jest na tyle duże, że hamuje wzrost obydwu szczepów (wąska strefa wolna od wzrostu), w dalszej odległości od krążka stężenie antybiotyku maleje, wzrost jednego ze szczepów zostaje zahamowany, a drugi rośnie.
• Oporne mutanty – czasem pewien procent komórek jest zmutowanych i zdolnych do wzrostu w strefie zahamowania wzrostu normalnych komórek. Istnieją także mutanty zdolne do wzrostu jedynie w obecności konkretnego antybiotyku (np. mutanty zależne od streptomycyny).
• Zakażenia – w inokulum może znajdować się mieszanina mikroorganizmów, z których przynajmniej jeden jest oporny na dany antybiotyk.
• Synergizm – dwa krążki zawierają różne antybiotyki, strefa zahamowania wzrostu jest większa niż suma efektów każdego antybiotyku z osobna.
• Antagonizm – dwa krążki zawierają różne antybiotyki, ale jeden z antybiotyków hamuje działanie drugiego.

interpretacja

Sposób interpretacji opracowano poprzez porównywanie strefy zahamowania wzrostu metodą dyfuzji i oznaczenia MIC. Na ogół porównuje się do wartości granicznych opracowanych przez Comité de l’Antibiogramme de la Societé Française de Microbiologie (Komitet ds. Oznaczania Wrażliwości Drobnoustrojów Francuskiego Towarzystwa Mikrobiologicznego).

Przyjmuje się trzy (Comité de l’Antibiogramme de la Societé Française de Microbiologie) albo cztery stopnie w ocenie wrażliwości:

• Wrażliwe (oznaczenie S lub W lub ++) – leczenie zwykłą dawką antybiotyku powinno być skuteczne. Istnieje duża szansa na wyleczenie.
• Umiarkowanie wrażliwe (MS – nie występuje we wszystkich krajach, jest łączone wtedy z kategorią „średnio wrażliwe”) – powinno się zastosować zwiększoną dawkę antybiotyku lub zwiększoną częstotliwość podawania. Szansa na wyleczenie jest mniejsza, ale istnieje.
• Średnio wrażliwe (I, SW, +) – leczenie możliwe jest tylko bardzo wysoką dawką, na granicy toksyczności; należy je stosować tylko w przypadku braku innych możliwości.
• Oporne (R, O, -) – antybiotyk nie powinien być stosowany w leczeniu. Nie istnieje realna szansa na wyleczenie.

Granice tych kategorii są jednak bardziej umowne, nie są ścisłym odbiciem właściwości bakterii. W interpretacji antybiogramu ważne jest też określenie mechanizmów oporności.

Metoda rozcieńczeń w podłożu stałym lub płynnym

W probówkach lub płytkach z agarem wykonuje się serię rozcieńczeń antybiotyku w postępie geometrycznym (o ilorazie 2); dodatkowa probówka kontrolna nie zawiera antybiotyku. Do każdej probówki dodaje się odpowiednio rozcieńczone inokulum (106 bakterii na ml).

MIC czyli najmniejsze stężenie hamujące wzrost bakterii możliwy do stwierdzenia gołym okiem odczytuje się po inkubacji przez 18-24 godzin w temperaturze 37°C.

Jest to metoda czasochłonna i mało precyzyjna, aktualnie raczej nie stosowana.  

Metody automatyczne

Aktualnie coraz częściej stosuje się półautomatyczną metodę ATB (bioMeieux) oraz automatyczną VITEK.

Sposób wykonania (ATB)

Bakteryjne inokulum w pożywce wprowadza się do mikrocel płytki zawierających standardowe stężenia leków. Wzrost bakterii ocenia się w czytniku na podstawie zmętnienia pożywki.

Należy przygotować zawiesinę badanego szczepu w 0,85% NaCl odpowiadającą zmętnieniu w skali McFarlanda: 0,5 stopnia dla bakterii tlenowych i 3 stopnie dla beztlenowych. Następnie przenosi się odpowiednią ilość zawiesiny na półpłynne podłoże ATB. Po wymieszaniu wkrapla się inokulum do mikrocel. Po 18 godzinach inkubacji odczytuje się wynik w czytniku. Stopień zmętnienia wskazuje na działanie leku. Podłoże przezroczyste wskazuje na zahamowanie wzrostu bakterii. Badanie to przeprowadza się w kierunku konkretnych grup bakterii, dla których bada się działanie konkretnych antybiotyków.

VITEK

System VITEK służy do automatycznej identyfikacji drobnoustrojów oraz określania lekowrażliwości. Istnieją różne rodzaje tego systemu. Generalnie wyniki podawane są w postaci MIC oraz kategorii (S, I, R). Możliwe jest także zidentyfikowanie mechanizmów oporności (np. MRSA, ESBL). W niektórych przypadkach klinicznych wymagane są dodatkowe dokładne informacje na temat wartości MIC. W sytuacjach takich ilościowe dane o wartości MIC są zasadniczym warunkiem właściwego leczenia. Jest to szczególie ważne w przypadku nadzorowania ciężkich infekcji np. sepsy.

Istnieją różne urządzenia różniące się możliwościami technicznymi, które są mniej lub bardziej zaawansowane.

Przy wykonywaniu automatycznych antybiogramów otrzymanie wyników możliwe jest jeszcze tego samego dnia. Jest to bardzo ważne ponieważ pozwala na szybkie rozpoczęcie właściwej terapii.

Na ogół laboratoria mają standardowe zestawy antybiotyków stosowanych do testów. W przypadku badań weterynaryjnych ważne jest wykonywanie testów w laboratoriach weterynaryjnych ze względu na stosowanie niektórych innych leków. W konkretnych przypadkach, za dodatkową opłatą, w przypadku wykonywania antybiogramu ręcznie (metodą krążkową) możliwe jest wykonanie badania na dodatkowe, spoza standardowego zestawu, antybiotyków.

W przypadku automatów możliwości te są mniejsze, ponieważ istnieją ograniczenia odczynników.

Na koniec trzeba zaznaczyć, że nie zawsze antybiotyk działający in vitro będzie tak samo działał in vivo. Dzieje się tak dlatego, że warunki in vitro są inne niż in vivo. Dodatkowymi czynnikami ograniczającymi niekiedy działanie leku jest stan zwierzęcia, sposób podania, a co za tym idzie odpowiedniego wchłonięcia się leku, częstotliwość podawania itd.

Źródła: Malicki K., Binek M.: Zarys klinicznej bakteriologii weterynaryjnej, Wydawnictwo SGGW 2004.; Quinn P. J. i inni: Veterinary Microbiology and Microbial Disease, Blackwell Science 2001; Singleton P.: Bakterie w biologii, biotechnologii i medycynie, Wydawnictwo Naukowe PWN 2000; Strony internetowe firmy bioMérieux

(aktualne 16 maja 2012)